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            常見的熒光定量PCR檢測方法有哪些?

            更新時間:2023-04-04      點擊次數:1218
            實時熒光定量PCR,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。常見的熒光定量PCR檢測方法有SYBR Green I熒光嵌合法和熒光探針法。

            SYBR Green I熒光嵌合法:
            SYBR Green I 是一種能與雙鏈 DNA 結合發光的熒光染料。其與雙鏈 DNA 結合后, 熒光大大增強。因此, SYBR Green I 的熒光信號強度與雙鏈 DNA 的數量相關,可以根據熒光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數量。SYBR Green I 的最大吸收波長約為 497nm,發射波長最大約為 520nm。PCR 擴增程序一般為 94℃~55℃~72℃三步法,40 個循環。SYBR Green I 的缺點:由于 SYBR Green I 沒有特異性,不能識別特定的雙鏈,只要是雙鏈就會結合發光,對 PCR 反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會產生熒光,通常本底較高,所以在臨床上使用可能會有假陽性發生。
             
            SYBR Green I 的優點:SYBR Green I 的優點是因為其缺點產生,由于它能所有的雙鏈DNA相結合,所以對不同模板不需特別定制不同的特異性探針,通用性較好,并且價格相對較低。這對科研是很有利的,因此國內外在科研中使用比較普遍。

            熒光探針法:
            探針法通常是使用5’端帶有熒光物質(如:FAM等),3’端帶有淬滅物質(如:TAMRA、Eclipse、BHQ等)的探針進行熒光檢測的方法。當探針完整時,5’端的熒光物質受到3’端的淬滅物質的制約,不能檢出熒光。探針的報告基團的發射波長要在淬滅基團的吸收波長范圍內。

            能用于實時熒光 PCR 定量的方法很多,各有優缺點,必須根據具體的實驗用途進行選擇。如果用于區別同源性高的序列以及進行SNP分型解析等多重PCR檢測,推薦用熒光探針法,而進行除此之外的Real Time PCR實驗,我們推薦使用簡單易行、成本低的SYBR Green I熒光嵌合法。
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